雙光子顯微鏡（TPM）使研究人員能夠以高分辨率觀察活組織中復雜的生物過程，從而徹底改變了生物學領域。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術相比，TPM利用低能光子激發(fā)熒光分子進行觀察。反過來，這使得可以更深入地穿透組織，并確保熒光分子或熒光團不會被激發(fā)激光永久損壞。

然而，一些生物過程太快而無法記錄，即使使用最先進的TPM。限制 TPM 性能的設計參數(shù)之一是線路掃描頻率，以每秒幀數(shù) （FPS） 為單位。這是指激發(fā)激光沿一個方向（例如，在水平掃描中）掃描目標樣品的速率。緩慢的掃描頻率也會影響系統(tǒng)的整體FPS，因為它決定了激光掃過另一個方向的速度，即垂直掃描�？傊�，這些在顯微鏡的時間分辨率和觀察框的尺寸之間產(chǎn)生了權衡。

通過結合兩種激光掃描模式，研究人員開發(fā)了一種多功能的雙光子顯微鏡系統(tǒng)，可用于以高幀速率和空間分辨率觀察極快的生物過程。

為了解決這個問題，來自中國和德國的一個國際研究小組最近開發(fā)了一種功能強大的TPM設置，具有前所未有的高線掃描頻率。根據(jù)他們發(fā)表在《神經(jīng)光子學》上的報告，這種顯微鏡系統(tǒng)設計用于以高時間和空間分辨率對快速生物過程進行成像。

將所提出的TPM與傳統(tǒng)TPM區(qū)分開來的關鍵因素之一是使用聲光偏轉器（AOD）來控制激發(fā)激光器的掃描。AOD是一種特殊類型的晶體，其折射率可以通過聲波精確控制。反過來，這使我們能夠根據(jù)需要重定向激光束通過它。更重要的是，與傳統(tǒng)TPM中使用的振鏡相比，AOD可實現(xiàn)更快的激光轉向。

因此，該團隊使用二氧化碲（TeO）設計了一種具有極高聲速的定制AOD晶體，實現(xiàn)高線掃描頻率。使用此AOD，激光器可以在短短2.5微秒內(nèi)掃描幀中的一條線，對應于400 kHz的最大線掃描頻率。同樣，該團隊使用AOD在另一個方向上實現(xiàn)了合理的慢掃描頻率。

為了進一步提高顯微鏡的適應性，該團隊增加了在必要時切換到基于振鏡的激光掃描機制的選項。這允許以可接受的分辨率和速度掃描樣品的大區(qū)域，從而在切換到AOD掃描之前更容易找到感興趣的小區(qū)域。

該團隊對新設計的TPM進行了幾次概念驗證實驗。他們在基因工程小鼠上安裝了顱窗，并用它們來觀察神經(jīng)元的形態(tài)和活動以及單個紅細胞（RBC）的運動。該系統(tǒng)使用適當?shù)?nbsp;AOD 配置和幀大小實現(xiàn)了高達10,000 FPS 的幀速率。這足以精確測量鈣在神經(jīng)元樹突中傳播的速度，以及可視化血管內(nèi)單個紅細胞的軌跡。

加州大學伯克利分校神經(jīng)光子學副主編兼Luis Alvarez實驗物理學紀念主席Na Ji博士對這些結果印象深刻，他說：“基于AOD的掃描顯微鏡的新系統(tǒng)代表了成像速度和性能的顯著提高，正如其在體內(nèi)鈣信號傳播和血流測量中的應用所證明的那樣。

展望未來，新的概念驗證TPM設計將使捕獲快速生物過程成為可能，并可以顯著提高我們對它們的理解。

相關鏈接：https://phys.org/news/2023-05-high-speed-two-photon-microscope-precise-biological.html