中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究組在《自然-方法》（Nature Methods）上在線發(fā)表了題為Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals的研究論文。該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了新型超分辨顯微成像技術(shù)，解決了背景噪聲干擾和運(yùn)動(dòng)偽影兩大技術(shù)難題，可在清醒動(dòng)物腦中對(duì)神經(jīng)元的快速動(dòng)態(tài)進(jìn)行超分辨率光學(xué)成像和解析，為探討動(dòng)物學(xué)習(xí)過(guò)程中的神經(jīng)元突觸可塑性基礎(chǔ)提供了新工具。

近年來(lái)，新發(fā)展的超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)可突破光學(xué)衍射極限。目前，由于面臨多項(xiàng)技術(shù)難點(diǎn)，超分辨率熒光顯微鏡多應(yīng)用于離體的細(xì)胞和腦片研究，未有技術(shù)能夠在清醒動(dòng)物中超分辨解析正常生理和行為狀態(tài)下突觸的結(jié)構(gòu)和功能。因此，開(kāi)發(fā)可應(yīng)用于清醒動(dòng)物的超分辨光學(xué)成像新技術(shù)是神經(jīng)科學(xué)和光學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)前沿。

該團(tuán)隊(duì)提出了多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)（MLS-SIM）。MLS-SIM的關(guān)鍵創(chuàng)新在于提出了在單次線掃描成像過(guò)程中通過(guò)快速切換不同的線照明模式來(lái)分別獲得三個(gè)方向上的超分辨信息，并提出了新的超分辨重構(gòu)理論框架以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確高效的超分辨圖像重構(gòu)。在線性熒光激發(fā)模式下，MLS-SIM可以150納米橫向分辨率對(duì)清醒小鼠皮層中神經(jīng)元樹(shù)突棘尖刺和軸突終扣微觀動(dòng)態(tài)開(kāi)展長(zhǎng)達(dá)上千幀的連續(xù)成像，且速度達(dá)每秒數(shù)幀；可容忍每秒50微米的樣品運(yùn)動(dòng)而不影響其超分辨成像性能。進(jìn)一步，通過(guò)皮秒脈沖激光實(shí)現(xiàn)非線性熒光激發(fā)，非線性MLS-SIM可以將橫向分辨率提高至約100納米，且保持同樣的樣品運(yùn)動(dòng)容忍度。

MLS-SIM填補(bǔ)了超分辨顯微鏡在清醒動(dòng)物上開(kāi)展成像的空白，并彌補(bǔ)了以往技術(shù)在活體動(dòng)物成像時(shí)長(zhǎng)和光漂白特性的不足，為在體微觀研究開(kāi)辟了前景。利用這一技術(shù)，該研究在清醒的小鼠大腦中驗(yàn)證了神經(jīng)元樹(shù)突棘和軸突終扣上存在快速變化的尖刺動(dòng)態(tài)，并量化研究了清醒-睡眠循環(huán)中神經(jīng)元的微觀快速動(dòng)態(tài)的改變。同時(shí)，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了雙色超分辨同時(shí)成像，剖析了PSD-95蛋白聚團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)與樹(shù)突棘發(fā)生之間的聯(lián)系。研究在雙色成像實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突主干存在許多動(dòng)態(tài)的小突起。這種突起結(jié)構(gòu)的尺寸多小于傳統(tǒng)雙光子成像技術(shù)的解析能力，只能通過(guò)超分辨成像進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。動(dòng)態(tài)觀察顯示，樹(shù)突主干上的PSD-95聚團(tuán)附近存在頻繁的小突起生成現(xiàn)象。進(jìn)而，研究通過(guò)對(duì)一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突主干上的PSD-95聚團(tuán)和主干上的小突起存在顯著的共定位現(xiàn)象。這一新發(fā)現(xiàn)的小突起結(jié)構(gòu)及其與PSD-95的共定位可能暗含樹(shù)突棘發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制，為未來(lái)突觸可塑性研究提供了新證據(jù)。

MLS-SIM應(yīng)用于清醒小鼠皮層超分辨成像

這一技術(shù)使得在清醒動(dòng)物生理狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元及其他細(xì)胞的亞細(xì)胞微觀動(dòng)態(tài)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間、大范圍的成像和分析成為可能，為超分辨成像在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新工具。

研究工作得到科學(xué)技術(shù)部、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)及中國(guó)博士后科學(xué)基金的支持。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02535-9