摘 要 激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學(xué)圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細(xì)胞動力學(xué)參數(shù)監(jiān)測和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學(xué)顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個補(bǔ)充。本文以美國Meridian公司的ACAS ULTIMA312為例簡要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，功能和生物學(xué)應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞 激光；共聚焦顯微鏡；粘附細(xì)胞分析與篩選（ACAS） YH^@8   
The Laser Scanning Confocal Microscopy System and its Biological Applications S0r+Y0J]<  
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Chen Yaowen ,Lin Jielong ,Lai Xiaoying ,Mei Pinchao aX|(%1r  
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(Shantou Uni.Med .College,Central Lab ,Shantou Guangdong 515031) b+hN\/*]  
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Ahstract The Laser Scanning Confocal Microscopy is a new medical image analysis instrument ,which is developed in the last decade.Now it is widely applied in such fields as fluorescent quantitative measurement ,conpocal image andlyusis ,3-D reconstruction ,Kinetic signal monitioring of living cell ,cellcell communication researches ,etc .In this paper ,ACSA ULTIMA 312(Meridian Co,USA)is taken as an example to introduce the principle of confocal microscopy ,its funetions and biological applications. '}bmDb*  
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Key words Laser Confocal Microscopy Adherent Cell Analysis and sorting(ACSA) Zt=P 
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激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal Microscopy ，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域[1、2、3]，對生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。 hH%fWB2(  
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創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項(xiàng)具有劃時(shí)代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎”，它能達(dá)到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器�，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。 R?- zJ ;  
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1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成 5a)$:oO!  
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有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。 }Ujgd2(U  
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激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過焦點(diǎn)處的針孔，由檢測器接收。 .P?n<n#  
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從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達(dá)檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。 ]?oJxW.  
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ACAS ULTIMa 312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點(diǎn)掃描成像，由于樣品中不同的掃描點(diǎn)始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達(dá)0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描樣品時(shí)，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進(jìn)馬達(dá)控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標(biāo)本的不同層面上，可以逐層獲得標(biāo)本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱為“光學(xué)切片”。再利用計(jì)算機(jī)的圖像處理及三維重建軟件�？梢缘玫礁咔逦�度來表現(xiàn)標(biāo)本的外形剖面，十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 zfg+gd)Z
 
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2、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng) Z'}%Mkm`i}  
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2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及參數(shù)指標(biāo)　激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999 mW的可見光），能同時(shí)/順序/分別輸出紫外光和可見光，激發(fā)波長為351-364nm；488nm；514nm�！∮�(jì)算機(jī)系統(tǒng)：80586/133MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盤/150MB Bernoulli盤驅(qū)動器/17’’大屏幕顯示器�！」簿劢瓜到y(tǒng)：計(jì)算機(jī)自動控制光路準(zhǔn)調(diào)節(jié)；計(jì)算機(jī)控制孔徑校準(zhǔn)；計(jì)算機(jī)調(diào)節(jié)孔徑大��；自動Z軸調(diào)節(jié)（最小0.1μm）。　光學(xué)探測系統(tǒng)：3個測窗式PMT采集熒光；1個CCD系統(tǒng)；12位的高速A/D轉(zhuǎn)換器。　圖像分辨率：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級。　掃描方式：快速鏡掃描Dual Scan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm ；掃描平面：XY和XZ和獨(dú)特點(diǎn)、線、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統(tǒng) 19!;0fe=  
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ACAS ULTIMa 312系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的軟件將激光細(xì)胞儀與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能�；�于生物醫(yī)學(xué)研究有如下的軟件。 b0@K ~O;g  
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Image Analyze―對于單色、比色和三色標(biāo)記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時(shí)Auto Image可多個區(qū)域的自動掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時(shí)間順序掃描�！�Ratio Analysis和 Kinetics―測定細(xì)胞內(nèi)的離子變化，可有點(diǎn)掃描、線掃描及圖像掃描三種測定形式，以監(jiān)測各種速率的生物反應(yīng)。　Cell ?CCell Communication and FRAP-相鄰細(xì)胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細(xì)胞熒光，然后在多個時(shí)間點(diǎn)掃描，此掃描可對單一區(qū)域或細(xì)胞的多個選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊。　Cell List―儲存被選擇細(xì)胞的位置，即可自動對較大樣品進(jìn)行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡(luò)位置表，以進(jìn)行自動的測量、篩選和重復(fù)測定�！�Cell Sorting―ACAS具備如下四種分選方式：　Ablation Sort:預(yù)選定義一個熒光閾值 ，然后對特定細(xì)胞殺傷。②CookieCutter Sort在用戶定義的中心點(diǎn)四周切割Cookies。③Quick Sort：對已定義的細(xì)胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分選。④Manual Sort：直接使用鼠標(biāo)控制載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作�！�Confocal Imaging―共聚焦分析，可實(shí)現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點(diǎn)移動動畫。 gMkS
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3 激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用
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3.1 定量熒光測量 U0{)goN.  
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ACAS可進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測及活細(xì)胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準(zhǔn)確監(jiān)測抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息。 u=vBjaN2_w  
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3.2 定量共聚焦圖像分析 (~E-=+R[$&  
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借助于ACAS 激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像�？傻玫酵暾�活的或固定的細(xì)胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測定細(xì)胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴(kuò)散、胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)及定位分析。 }&2,!;"">3  

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3.3 三維重組分析生物結(jié)構(gòu) _G'A]O/BZD