光掃描共焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是上世紀(jì)80年代開始投入實(shí)際應(yīng)用的一種顯微設(shè)備。與普通光學(xué)顯微鏡相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以對(duì)觀測樣品進(jìn)行分層掃描，實(shí)現(xiàn)樣品的三維重建和測量分析; 與電子顯微鏡相比，LSCM可以在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值和膜電位等生理信號(hào)及活細(xì)胞形態(tài)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。因此，這項(xiàng)產(chǎn)品的面世是顯微成像技術(shù)發(fā)展史中具有劃時(shí)代意義的重大進(jìn)展。LSCM在形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以及材料學(xué)、地質(zhì)學(xué)、水利學(xué)等工業(yè)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。根據(jù)應(yīng)用方向的不同，可分為生物用激光掃描共焦顯微鏡和工業(yè)用激光掃描共焦顯微鏡。 z@ WuKRsi
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一.LSCM的基本原理及結(jié)構(gòu)特點(diǎn) H"~]|@g-p
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普通光學(xué)顯微鏡使用的鹵素?zé)艄庠礊榛旌瞎�，光譜范圍寬，成像時(shí)樣品上每個(gè)照光點(diǎn)均會(huì)受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成像質(zhì)量。而LSCM結(jié)構(gòu)上采用精密共焦空間濾波，形成物象共軛的獨(dú)特設(shè)計(jì)，激光經(jīng)物鏡焦平面上針孔形成點(diǎn)光源對(duì)樣品掃描，于測量透鏡焦平面的探測針孔處經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點(diǎn)形成的雜散熒光和樣品不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。這是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)物象共軛，只有物鏡焦平面上的點(diǎn)經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點(diǎn)圖像，掃描后可得到信噪比極高的光學(xué)斷層圖像，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象地稱為“顯微CT”。 5v1f?btc
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LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細(xì)胞檢測等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。 G-5wv
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二.LSCM的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用 \?n4d#=$o
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LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞生物學(xué)研究上了一個(gè)臺(tái)階。目前我們可以在亞細(xì)胞水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細(xì)胞在生理、病理和藥理情況下對(duì)外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應(yīng)，進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位的分析測量。最常用的功能是細(xì)胞三維重建、細(xì)胞熒光檢測等。 4}mp~AXy;z
1. 細(xì)胞的三維重建 Jxyeh1z qB
普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結(jié)構(gòu)為多層面的圖像疊加，結(jié)構(gòu)不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可從不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細(xì)胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動(dòng)畫效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析、染色體分析、細(xì)胞程序化死亡的觀察、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測等方面。 p1zT]
2. 細(xì)胞定量熒光測定 U%E 6"Hg
顯微熒光光度計(jì)由于顯微鏡和激發(fā)光源的限制成像模糊，只能測定細(xì)胞內(nèi)的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為光源，對(duì)細(xì)胞分層掃描，單獨(dú)測定，經(jīng)積分后能得到細(xì)胞熒光的準(zhǔn)確定量，重復(fù)性極佳。它適于活細(xì)胞的定量分析，可測定細(xì)胞內(nèi)溶酶體、線粒體、DNA含量、RNA含量、酶和結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量和分布，常用于原位分子雜交、腫瘤細(xì)胞識(shí)別、單個(gè)活細(xì)胞水平的DNA損傷及修復(fù)的定量分析。它適于快速高靈敏度測量，減少光猝滅的影響，在定量免疫熒光測定方面應(yīng)用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達(dá)的定量分析，監(jiān)測腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的定位定量信息，監(jiān)測藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測自身免疫性疾病的多種抗原及藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)特征并作定量分析等。細(xì)胞定量熒光測定可選用單熒光、雙熒光方式，能自動(dòng)測定細(xì)胞面積、平均熒光強(qiáng)度、積分熒光強(qiáng)度及形狀因子等多種參數(shù)。 '] 'H8Y-M
3. 細(xì)胞內(nèi)鈣離子pH值和其它離子的動(dòng)態(tài)分析 dy>iI c>
通過一些專用熒光探針，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及pH值等作熒光標(biāo)記，并對(duì)它們進(jìn)行比率值和濃度梯度變化測定。由于細(xì)胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對(duì)細(xì)胞生長分化起著重要作用，通過單標(biāo)記或雙標(biāo)記對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和其它離子的熒光強(qiáng)度和分布精確測定，測定樣品達(dá)到毫秒級(jí)的快速變化。借助光學(xué)切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細(xì)胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特性的變化。通過不同時(shí)間段的檢測可測定細(xì)胞內(nèi)離子的擴(kuò)散速率，了解它對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長因子等刺激的反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)離子測量廣泛用于腫瘤研究、組織胚胎學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域。 |$$gj[+^
4. 細(xì)胞胞間通信和膜的流動(dòng)性 N*d
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動(dòng)物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。通過測量細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信的抑制作用及細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值等對(duì)縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測環(huán)境毒素和藥物在細(xì)胞增殖和分化中所起到的作用。選定經(jīng)熒光染色后的細(xì)胞，借助于光漂白作用或光損傷作用使細(xì)胞部分或整體不發(fā)熒光，實(shí)時(shí)觀察檢測熒光的恢復(fù)過程，可直接反映細(xì)胞胞間通信結(jié)果。 g[Tl#X7F
細(xì)胞膜的流動(dòng)性在進(jìn)行膜的磷脂酸組成分析，藥物作用點(diǎn)和藥物作用效應(yīng)，測定溫度反應(yīng)和物種比較方面有重要作用。細(xì)胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運(yùn)動(dòng)自由度取決于熒光分子周圍的膜流動(dòng)性，所以極性測量能間接反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性。 +f#o ij
綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點(diǎn)，在細(xì)胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細(xì)胞學(xué)的一項(xiàng)重要研究手段。隨著LSCM設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的不斷完善，它在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域里將起到更重要的作用。
