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jackaroo

2006-06-04 15:14

分光光度分析--熒光光譜分析

當紫外光照射某一物質時，該物質會在極短的時間內，發(fā)射出較照射波長為長的光。而當紫外光停止照射時，這種光也隨之很快消失，這種光稱為熒光。熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象。如前所述，分子吸收了某一波長區(qū)的輻射能后，它的電子可躍遷至激發(fā)態(tài)，然后以熱能形式將這一部分能量釋放出來，本身又恢復到基態(tài)。如果吸收輻射能后處于電子激發(fā)態(tài)的分子以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，即為光至發(fā)光。再發(fā)射的波長與分子所吸收的波長可以相同，也可以不同。物質所吸收光的波長和發(fā)射的熒光波長與物質分子結構有密切關系。同一種分子結構的物質，用同一波長的激發(fā)光照射，可發(fā)射相同波長的熒光，但其所發(fā)射的熒光強度隨著該物質濃度的增大而增強。利用這些性質對物質進行定性和定量分析的方法，稱為熒光光譜分析法，也稱為熒光分光光度法。這種方法具較高的選擇性及靈敏度，試樣量少，操作簡單，且能提供比較多的物理參數(shù)，現(xiàn)已成為生化分析和研究的常用手段。

1. 熒光的產生及其與分子結構的關系：

1) 熒光的產生：

當光進入某種物質后，可以有兩種情況：一種是進入物質后，能量幾乎不被吸收；另一種是能量被全部或部分吸收。在后一種情況下，在吸收光的過程中，光能被轉移給分子。根據量子理論，分子從光波中吸收能量是不連續(xù)的、整份單位的形式發(fā)生，這些不連續(xù)的微小能量單位被稱為光量子。這也就是說，頻率n的單色光的能量必定是hn的整數(shù)倍。每個光量子的能量

E=hn=hc/λ=hcω,

這里，h為普朗克常數(shù)，6.63×10－34J/s；ω為波長，即1cm長度中電磁波的數(shù)目。從公式可見，能量E與λ成反比。

每個分子具有一系列分子的能級，處于基態(tài)的分子吸收了相應頻率的能量后，可以從低能級躍遷到高能級。被吸收的光量子的能量正好等于兩個能級之差。

根據玻爾茲曼分布，分子在室溫時基本上處于電子的基態(tài)。吸收了紫外－可見光后，基態(tài)電子只能躍遷到單線激發(fā)態(tài)的各個不同的震動能級。躍遷后能量較大的激發(fā)態(tài)分子，在很短時間內（10—15s），由于分子間的碰撞或分子與晶格間的相互作用，以熱能形式或內轉換方式消耗部分能量，從較高震動能級回到最低震動能級。如果這時分子不通過熱能或內轉換形式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同震動能級時，就發(fā)射熒光。由于在發(fā)射熒光前已有一部分能量消耗，所以發(fā)射熒光能量要比吸收紫外光的能量小，也就是熒光的特征波長比吸收的特征波長要長。

2) 熒光與分子結構的關系：

在許多有機物和無機物中，只有小部分物質會發(fā)生強的熒光，它們的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及熒光強度與它們的結構有密切的關系。強熒光物質在分子結構上往往具有如下特征：

a. 具有大的共軛π鍵結構：共軛體系越大，離域π電子越容易激發(fā)，越容易產生熒光。大部分熒光物質都有芳香環(huán)或雜環(huán)。芳香環(huán)越大，其熒光峰移向波長方向，且熒光強度也往往較強。具有相同共軛環(huán)數(shù)的芳香族化合物，線性環(huán)結構者的熒光波長比非線性者長。
b. 具有剛性平面結構：熒光量子產率高的熒光物質，其分子多為平面構型，并具有一定的剛性。
c. 具有最低的單線電子激發(fā)態(tài)S1為π，π1型。
d. 取代基團為給電子取代基。芳香烴及雜環(huán)化合物的熒光光譜和熒光量子產率常隨取代基的變化而變化。若取代基為給電子取代基，則熒光強度增加。屬于這一類基團的有—NH2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN。
2. 熒光分光光度計：

熒光分析從入射光的直角方向、黑背景下檢測樣品的發(fā)光信號，這與紫外分光光度法從入射光方向、在亮背景下檢測光吸收信號相比，具有更高的靈敏度。此外熒光分析在檢測器前面是發(fā)射單色器，樣品信號經過分光后可以去除樣品以外的輻射，從而為方法的專一性提供了有力的條件。

用于測量熒光的儀器種類很多，如熒光分析燈、熒光光度計、熒光分光光度計及測量熒光偏振的裝置等。其中實驗室里常用的是熒光分光光度計。

熒光分光光度計的結構包括五個基本部分：

1) 激光光源：用來激發(fā)樣品中熒光分子產生熒光。常用汞弧燈、氫弧燈及氘燈等，目前熒光分光光度計以用氘燈為多。
2) 單色器：用來分離出所需要的單色光。儀器中具有兩個單色器：一是激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光波長；二是發(fā)射單色器，用于選擇發(fā)射到檢測器上的熒光波長。
3) 樣品池：放置測試樣品，都用石英做成。
4) 檢測器：作用是接受光信號，并將其轉變?yōu)殡娦盘枴?span style="display:none"> 47Vt8oyh%
5) 記錄顯示系統(tǒng)：檢測器出來的電信號經過放大器放大后，由記錄儀記錄下來，并可數(shù)字顯示和打印。

3. 熒光分析法：

熒光分析方法根據不同的目的性，有多種分析方法，諸如同步熒光測定、三維熒光光譜技術、導數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辯熒光測定、熒光偏振測定、低溫熒光測定、熒光免疫檢測等等，各種不同的分析方法在儀器配置上常需要添加相應的配件。這些方法在此不作詳細敘述，只討論常規(guī)的熒光分析法。

1) 直接測定法和間接測定法：

利用熒光分析法對被分析物質進行濃度測定，最簡單的便是直接測定法。某些物質只要本身能發(fā)熒光，只須將含這類物質的樣品作適當?shù)那疤幚砘蚍蛛x除去干擾物質，即可通過測量它的熒光強度來測定其濃度。

有許多物質，它們本身不能發(fā)熒光，或者熒光量子產率很低僅能顯現(xiàn)非常微弱的熒光，無法直接測定，這時可采用間接測定方法。

間接測定方法有以下幾種：

a. 化學轉化法：通過化學反應將非熒光物質轉變?yōu)檫m合于測定的熒光物質。例如，金屬離子與螯合劑反應生成具有熒光的螯合物。有機化合物可通過光化學反應、降解、氧化還原、偶聯(lián)、縮合或酶促反應，使它們轉化為熒光物質。