在分光光度計(jì)中，將不同波長(zhǎng)的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí)，便可得到與眾不同波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度。如以波長(zhǎng)（λ）為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測(cè)定有色物質(zhì)的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ)。
近年來(lái)，紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應(yīng)用，它不僅可以用于物質(zhì)的鑒定及結(jié)構(gòu)分析，而且還可以用于某些物質(zhì)含量的測(cè)定。
分光光譜技術(shù)可用于：
1) 通過測(cè)定某種物質(zhì)吸收或發(fā)射光譜來(lái)確定該物質(zhì)的組成。
一、紫外及可見光分光光度法
這是一種只在可見光及紫外光光譜應(yīng)用范圍內(nèi)測(cè)量物質(zhì)吸收輻射線的技術(shù)，應(yīng)用十分廣泛。其中分光光度計(jì)可用于精確測(cè)量特定波長(zhǎng)的吸收值，而比色計(jì)則是一種較簡(jiǎn)單的測(cè)量?jī)x器，其原理是利用慮光片來(lái)測(cè)量較寬波段（如可見光中的綠光、紅光或藍(lán)光范圍）的吸收值。
光吸收法則：
溶液對(duì)光的吸收有兩個(gè)基本法則：
1) 透過溶液的光的吸收值同吸收溶質(zhì)的分子數(shù)目（即溶質(zhì)濃度[C]）呈指數(shù)相關(guān)。
這兩條法則包括在比爾－朗伯關(guān)系式中。通常以入射光（Io）和出射光（I）的光密度來(lái)表示：
10(Io/I)=εl[C]
其中ε對(duì)于吸收物質(zhì)及波長(zhǎng)是一個(gè)常數(shù)，稱為吸光系數(shù)或吸收系數(shù)，[C]的單位為mol/L或g/L，l的單位為ml。這一公式非常有用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)分光光度計(jì)設(shè)計(jì)為直接測(cè)量log10(Io/I)的值（A）或消光值（E）（舊教材中可能使用以廢除的術(shù)語(yǔ)：光密度）。對(duì)于遵循比爾－朗伯關(guān)系的物質(zhì)，A與C呈線性關(guān)系。吸收值常用下標(biāo)表示其波長(zhǎng)，如A550表示550nm處的吸收值。透過溶液的光的比例稱為透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。
吸收值（A）（absorbance）——由公式得出：A= Log10(Io/I)
（一）比色計(jì)
比色計(jì)用于測(cè)定顏色明顯，并且是溶液主要組分的待測(cè)物，如血液中的血紅細(xì)胞，也可以在待測(cè)物之中加入一種試劑，使其形成有色產(chǎn)物（一種生色團(tuán)），如用茚三酮法測(cè)定氨基酸含量。定量分析某種物質(zhì)要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線是在測(cè)定待測(cè)樣品的同時(shí)測(cè)定已知含量的物質(zhì)來(lái)制成的，而不是使用比爾－朗伯關(guān)系。
光源通常為鎢絲燈泡，通過一個(gè)凸透鏡聚焦后產(chǎn)生一束平行光，平行光穿過裝有溶液的玻璃樣品或小池，然后透過一個(gè)有色濾光片到達(dá)光電管檢測(cè)儀，檢測(cè)儀產(chǎn)生一個(gè)同落在光電管上的光密度成正比的電勢(shì)，來(lái)自于光電管的信號(hào)被放大然后傳遞到電流計(jì)或數(shù)字讀數(shù)器。
比色計(jì)的使用：
①接通電源使儀器穩(wěn)定，使用前至少要讓燈預(yù)熱5min；② 選擇一種同底物顏色互補(bǔ)的濾光器；③調(diào)零（用空白對(duì)照調(diào)零）；④調(diào)整靈敏度；⑤分析樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液；⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同，因此為了提高精確度，同一試驗(yàn)應(yīng)用同一比色杯，且在比色槽中擺放的方位相同；⑦每次測(cè)樣前清洗比色杯；⑧經(jīng)常重復(fù)測(cè)定同一溶液檢驗(yàn)比色計(jì)的可重復(fù)性；⑨用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
由于大多數(shù)過濾器過濾出來(lái)的光的波帶很寬，因而比色計(jì)既不能用于確定某種復(fù)合物，也無(wú)法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質(zhì)。比色計(jì)所用光電管的變化系數(shù)為0.5%左右，因而不適合要求具有高度精確性的工作。使用這種最簡(jiǎn)單的儀器，由于儀表上對(duì)數(shù)測(cè)量刻度單位的隨意性，即使是把表上的靈敏度/刻度調(diào)節(jié)到零控點(diǎn)，在一個(gè)儀器上獲得的值不可直接同另一臺(tái)儀器上測(cè)得的值相比較，同一儀器的不同設(shè)置之間也不可直接比較。比色計(jì)對(duì)于特定波長(zhǎng)的量化工作是不合適的。[/C]