（二）紫外光/可見光分光光度計
紫外光/可見光分光光度計基本裝置中采用高強度的鎢燈作為光源，能夠在可見光范圍（400~700nm）調(diào)節(jié)。氘燈用于紫外分光光度測量（200~400nm）；使用氘燈時要用石英杯，因為紫外線不能透過玻璃。
分光光度計之所以優(yōu)于比色計就在于使用了一個衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束。實際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個波長的光，而是一段窄的帶寬上的光，帶寬是分光光度計的一個重要特性，這是由于它決定了吸收測量中所用的波長——普通分光光度計的帶寬為5~10nm，用于研究的儀器的帶寬小于1nm。
 因為光柵夾縫的寬度影響著帶寬，帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低，要獲得特定波長下的精確數(shù)據(jù)，盡可能使用最小的縫寬度。然而，減少了縫寬也會減少到達監(jiān)測器的光度，降低了信/噪比。縫寬可減少的程度取決于檢測/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在。
大多數(shù)UV/可見光分光光度計使用的比色杯的光穿過路徑為10nm。一次性塑料杯適合于對水和乙醇溶液在可見光范圍內(nèi)的測量。玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴格的標準，因而在精確研究中要使用玻璃比色杯，尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時（<0.1），即使盛對照液與待測樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同，也會導(dǎo)致結(jié)果偏差。玻璃和塑料會吸收UV光，因此在測波長小于300nm的吸收值時要使用石英杯。
進行測量之前，比色杯要保證干凈，無劃痕，外表面干燥，盛液到適當(dāng)高度，并放在了比色槽中的正確位置。生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過夜。腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯，以防止濺出，破壞儀器。
基本分光光度計使用的光電管類似于比色計中所使用的光電管。許多情況下，當(dāng)波長高于和低于550~600nm時必須使用不同的光電管，這是因為它們在可見光波長內(nèi)的靈敏度不同，更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測器。數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺錯誤和誤讀范圍的錯誤，正逐漸代替指針讀數(shù)。一些儀器可以直接給出所測定物質(zhì)的濃度。
1．紫外光/可見光分光光度計的類型：
基本分光光度計只產(chǎn)生單束光。這種儀器首先用空白對照調(diào)到零吸收值，然后取出空白液，加入待測液，測定待測液的吸收值。也有一種雙束分光光度計，有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束，一束穿過待測液，另一束穿過空白液。吸收值由一個電子線路通過對比透過待測液及空白液的出射光進行測定。雙光束分光光度計減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測量錯誤，這時由于待測液與對照液是同時進行測量的。記錄式分光光度計是一種雙束測定儀，用于記錄已知波段下吸收值隨時間的變化（如用于酶分析）。
2．分光光度計的定量分析：
假如已知一種物質(zhì)在某一波長下的吸光率（通常是該物質(zhì)的最大吸收值，這時靈敏度最高），這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼枺�朗伯關(guān)系式算出。摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下，比色杯厚度為1cm時的吸收值。該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到，也可以用實驗方法通過測量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來繪制一條標準曲線。這樣，在所要求的濃度范圍內(nèi)，便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系，該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。
比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時，比色杯厚度為1cm時測定的吸光值。該值對于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測定很有用，這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示。使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時，比吸光率要除以10才可以得到一個以g/L為單位的濃度值。
這種簡單的方法不能用于測定混合樣品。在這種情況下，也許可以通過測量幾個波長下的吸光度來估算每種成分的含量，如可用此方法在核酸存在下進行蛋白質(zhì)含量的估算。
分光光度計的使用方法：
（1）接通電源；（2）使用前預(yù)熱15min；（3）選擇波長；（4）選擇檢測器；（5）如果可能的話，選擇正確的縫寬；（6）插入適當(dāng)?shù)目瞻讓φ�；�?）調(diào)解到0%的透過率；（8）將吸光值調(diào)到零；（9）分析樣品；（10）每測量10個樣品后，用空白對照校驗零刻度；（11）檢測儀器的可重復(fù)性。
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