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北京大學(xué)實現(xiàn)高效超分辨活體組織成像新突破 在生物學(xué)研究的前沿，對活體組織中復(fù)雜三維亞細胞動態(tài)的非侵入性解析需求日益增長。為了實現(xiàn)空間分辨率、成像深度、光毒性三者的同時優(yōu)化，北京大學(xué)席鵬教授團隊將共聚焦掃描成像與結(jié)構(gòu)光超分辨巧妙結(jié)合起來，提出一種多點晶格共聚焦圖像掃描顯微解決方案，通過優(yōu)化針孔直徑和間距、消除離焦信號和引入減幀重建算法來克服現(xiàn)有技術(shù)在時空分辨率平衡方面的局限性，極大地擴展了超分辨率成像在生物體內(nèi)的應(yīng)用范圍。 隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，在組織層面揭示其內(nèi)部三維精細結(jié)構(gòu)、捕捉快速生物動態(tài)過程等成像需求日益增加。共聚焦激光掃描顯微技術(shù)因其卓越的光學(xué)切片能力和多功能性，在散射組織的深度成像中一直被視為首選。然而，縮小針孔尺寸以提升分辨率會導(dǎo)致信號下降，限制成像質(zhì)量。圖像掃描顯微技術(shù)（Image Scanning Microscopy，ISM）通過將單點探測器替換為探測器陣列，基于像素重定位和解卷積算法，在保持共聚焦層切能力的同時實現(xiàn)了相比于衍射極限兩倍的分辨率提升。相比于其他超分辨顯微技術(shù)，ISM更能抵抗深度成像時所引起的像差和散射等問題。 席鵬團隊提出多點共聚焦多點共聚焦圖像掃描顯微（Multi-confocal Image Scanning Microscopy，MC-ISM）技術(shù)，通過晶格針孔陣列產(chǎn)生多焦點照明，相比于傳統(tǒng)ISM利用單點進行掃描，這種并行化的配置配合類似阿基米德螺線的單振鏡掃描，極大提高了全視場成像速度。通過優(yōu)化針孔直徑和間距、應(yīng)用光學(xué)鎖相探測（OLID）處理抑制離焦信號，提高成像質(zhì)量�；谙袼刂囟ㄎ缓瓦M一步的解卷積后處理，MC-ISM可實現(xiàn)2倍的三維分辨率提升。此外，通過引入多圖反卷積重建算法進行減幀重建，MC-ISM可進一步提高成像速度，比多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡提高了16倍。  圖1. MC-ISM光路圖以及像素重分配和減幀重建結(jié)果 研究團隊利用MC-ISM技術(shù)對小鼠腎切片進行了三色3D超分辨成像，在66.5μm×66.5μm×12μm的體積內(nèi)，以150nm的軸向間隔實現(xiàn)了絲狀肌動蛋白、腎單位成分及核結(jié)構(gòu)的清晰分離，橫向與軸向分辨率分別提升至131nm和336nm。MC-ISM有效抑制了離焦信號，展現(xiàn)出與轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)切片能力。此外，使用20倍長工作距離物鏡，MC-ISM對DAPI染色的斑馬魚頭部進行深層成像，同樣展現(xiàn)出卓越的性能，在整個成像體積內(nèi)細胞結(jié)構(gòu)清晰可見。相較于寬場和共聚焦模態(tài)，分辨率顯著提升。  圖2. MC-ISM小鼠腎切片組織樣本和斑馬魚成像結(jié)果 MC-ISM因其簡化的探測光路而展現(xiàn)出增強的光子收集效率。在相同信噪比條件下，MC-ISM在1000幀成像后的熒光強度下降至67%，表明其光漂白程度低于OMX結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡、超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和Airyscan超分辨顯微鏡。此外，MC-ISM以7.5幀每秒的速度對U2OS細胞中的線粒體進行成像，過程中線粒體未發(fā)生腫脹現(xiàn)象，表現(xiàn)出成像系統(tǒng)極低的光毒性。在植物細胞中，MC-ISM成功克服了組織散射和自發(fā)熒光，實現(xiàn)了對擬南芥下胚軸內(nèi)線粒體的原位超分辨成像，展示了其在厚植物組織中超分辨成像的獨特優(yōu)勢。這些結(jié)果證明了MC-ISM系統(tǒng)在研究線粒體動態(tài)方面的優(yōu)越性和廣泛應(yīng)用潛力。  圖3. MC-ISM動物細胞線粒體和擬南芥下胚軸植物組織線粒體動態(tài)成像結(jié)果 破衍射極限現(xiàn)細胞真顏，執(zhí)細膩筆觸繪生命畫卷。憑借專門的硬件設(shè)計與先進算法的完美協(xié)同，MC-ISM深入樣本內(nèi)部，精細觀察組織深層結(jié)構(gòu)，以高速度捕捉瞬息萬變的生命體動態(tài)。其較低的光毒性使細胞得以自然地展現(xiàn)其生命力，從而揭示了生物體內(nèi)復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的奧秘。MC-ISM與現(xiàn)有共聚焦系統(tǒng)的高度兼容性，加之其成本效益和操作簡便性，使其成為引領(lǐng)下一代共聚焦顯微技術(shù)的強有力競爭者。 該成果以“Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy”為題發(fā)表于National Science Review（IF：16.3）。北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士生任偉、關(guān)美玲（現(xiàn)為中國科學(xué)院空天院博士后）和梁謙禧為共同第一作者。席鵬、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李美琪為本文的共同通訊作者。論文主要貢獻者還包括北京大學(xué)蘇都莫日根教授，金博雅博士，博士生段光興、張麗雅、侯宜偉，河北大學(xué)高保祥教授和研究生蓋希川。本工作得到科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金的支持，也得到北京艾銳精儀科技有限公司、北京大學(xué)國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心和光飛納科技公司的幫助。 相關(guān)鏈接：https://academic.oup.com/nsr/advance-article-abstract/doi/10.1093/nsr/nwae303/7742832 |
